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早期诊断和高通量样本筛查是控制新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情扩散的当务之急。分子诊断领域的逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR）和荧光定量（qRT-PCR）一直是COVID-19诊断的金标准。

然而，应用于临检中心实验室常规仪器的qRT-PCR受限于繁琐的样本收集、处理和扩增程序，较长的等待测试结果时间，以及熟练的技术人员操作复杂的设备等因素。因此，现场快速检测（POCT）被认为是解决上述挑战的前瞻性方法。

相较于常规qRT-PCR仪器，POCT所具备的仪器灵活便于部署、无需专业技能操作、检测结果快捷呈现等优势，将为基层医疗检测机构的新冠快速检测提供极大助力。

本文回顾了新冠病毒核酸检测的主要分子检测技术qRT-PCR，以及该类技术在POCT领域的适用性和目前活跃于国内和国外市场的检测核酸的分子POCT设备。〔尤其展现了目前在欧美市场受到热捧的适用于居家自检的POCT，作为将来国内分子诊断领域企业研发的新思路，以期为针对病原体核酸检测细分领域的分子POCT在我国的未来发展提供可作借鉴的系统性综述。〕新冠病毒核酸分子结构新型冠状病毒是一种有囊膜结构的单正链RNA病毒，属于β属冠状病毒，呈圆形或椭圆形，直径60-nm。它的囊膜结构包括四个主要部分：刺突蛋白（S），核衣壳蛋白（N），膜蛋白（M），和包膜蛋白（E），其中S蛋白由S1和S2两个亚基构成（图1）。S1亚基含有一个受体结合域（RBD），负责识别并与宿主细胞受体，即下呼吸道中的血管紧张素转换酶2受体（ACE2）结合。S蛋白是中和抗体和疫苗的共同目标，而S蛋白的氨基末端S1亚基是最易发生突变的免疫原性抗原。此外，新冠病毒的N蛋白模板mRNA是最丰富的亚基因组RNA，N蛋白表现出很高的免疫原性。在病毒复制周期和宿主细胞对病毒感染的反应中起着重要作用，在感染后10天左右达到病毒脱落的高峰。人群普遍易感。自新冠疫情爆发以来，新冠病毒本身表现出极快的变异速度，在多个国家发现不同的变异株，分别有B.1.1.7、B.1.、B.1..2等多个后来引发大规模感染和死亡病例的新冠变异株。这些变异株在病毒表面S蛋白的RBD发生了突变，使其更容易与人体细胞表面的ACE2受体结合。这些突变包括NY、AD、HV69-70del、KN、EK等。对新冠病毒及其变异株进行快速鉴别和监测已成为目前全球疫情防控工作的重点。新冠病毒感染的病理过程从感染的时间线来看，一旦病毒进入细胞，在潜伏期内，发热、干咳、头痛等临床症状可能出现。自新冠病毒感染开始的7天后，临床症状慢慢进展到肺炎，最终恶化为急性呼吸窘迫综合征，并在重症阶段有可能夺去患者生命。在感染的每个阶段，都会在宿主系统中释放出重要的生物标记物，此时选取恰当的检测手段，就能提高检出率。在潜伏期，临床上有诊断意义的重要生物标记物包括新冠病毒RNA和新冠病毒抗原，此时RT-PCR成为最有效的检测方法以确诊感染者。感染7天后，患者会产生IgG和IgM抗体，可通过血液样本检测发现。人体感染新冠病毒后，随时间推移所产生的可作为检测诊断用的生物标记物分泌水平的变化在图2中展示。用于POCT的新冠病毒核酸检测方法-qRT-PCR目前，实时荧光定量逆转录酶聚合酶链反应（qRT-PCR）被认为是检测SARS-CoV-2的“金标准”。它的优点是在一个封闭的系统中同时扩增和分析检测样本，可以防止扩增产物的污染，从而减少假阳性结果的机率，同时具有较高的灵敏度、特异性和准确率。qRT-PCR检测的原理是：SARS-CoV-2病毒的核糖核酸（RNA）被逆转录成互补的脱氧核糖核酸（cDNA），通过特异性引物与DNA聚合酶共同作用，对靶标核酸序列进行指数式扩增以进行检测，通过荧光标记探针所产生和积累的荧光进行实时监测反应和分析结果。它能检测鼻咽拭子样本中是否存在病毒核酸，确保特异性和敏感性。然而，RT-PCR因现有条件的限制，只能设医院、疾病控制中心、大型临床检测机构等专业场所。医院和基层门诊缺乏完善的PCR实验室设施和专业人员去处理大规模的样本。另外，虽然它是一种高灵敏度的技术，但仍然存在RT-PCR引起假阴性结果的风险。qRT-PCR这一核酸扩增检测的利器要真正应用于广泛意义上的大规模全员病原体筛查，不仅要在检测试剂盒和流程上不断改良，还需要突破传统的荧光PCR实验室平台的限制，降低技术实施的门槛。使面对待检者的一线机构和人员真正做到应检即检，随到随检，检测结果能够比对使用常规荧光PCR仪器和实验条件的中心实验室，这样可以尽可能地堵住疫情防控的死角。POCT的定义及应用场景POCT其含义可从两方面进行理解：空间上，在患者身边进行的检测，即“护理点检测”，时间上，为随时可行的“即时检测”。年，在多次专家论证基础上，中国医学装备协会POCT装备技术委员会形成了“现场快速检测（POCT）基层医疗卫生机构应用专家共识”，将其定义为：〔在采样现场进行的，利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的检测方式。〕随着诸如新冠肺炎等新发重大传染病的疫情快速诊断及精准医疗的需要，基于核酸检测的分子POCT系统所具有的自动、高通量、安全、快速、灵敏的特点，以及最小化对实验室设置、实验步骤及操作人员的要求的优势，将为分子诊断领域带来成本降低和检测效率提高的革命性发展。医院实验室普及到需要快速获得结果的基层医疗和临检机构、机场、车站、港口、大型会议中心等人流密集场所，在临床诊断和检测中具有显著的应用前景，能够更好地服务于人民健康。1.微流控技术平台：微流控，也称为芯片上的实验室（lab-on-a-chip），主要特征为在微纳米空间中对流体进行操控，提供了将不同的实验方法自动化和小型化为便携、紧凑、独立和一次性的系统，实现对样本和试剂的数量和流速精确控制。2.应用微流控的新冠核酸检测POCT典型产品：市售的大多数核酸检测POCT系统都有一个一次性的微流控样品单元（如试剂盒、试纸条或离心式卡盒）和一个高精度的读取器（如手持式或台式分析仪），用于现场分析。表1：从台式和手持设备两大范畴，以国产和海外制造所划分的代表性核酸检测POCT产品。POCT的思考1.目前存在的不足：本文作者认为，质量控制体系有待完善是POCT设备和试剂发展中最被人诟病之处。相比传统检测方法，POCT检测缺乏对照实验，这主要是因为POCT每个单元格都相对独立，因此确保每一批产品、每个测试单元都有可靠的稳定性成为一个挑战。居家自检产品，也因操作者对说明书的理解未必非常准确，而可能存在取样和检测中的误差，导致假阴性结果的出现。POCT结果尽管立等可取，在格式上，医院检验科的检测报告，更不是普遍纳入电子病历管理，对于长期的病情监测缺乏持续智能化的检测报告管理体系，而不利于临床医生长期借助这一手段对患者实施更有效的治疗。国内厂家在分子POCT产品的研发上，也存在技术原创性不够，同质化产品严重，从产品销售上升到平台服务的商业模式转型意识缺乏等阻碍行业发展的缺陷，产品的成本居高不下也是国内厂家亟需解决的问题。2.大数据和物联网时代的POCT发展：在当前信息通讯科技高速发展的时代背景下，5G通讯使万物互联不再是空想，附带蓝牙或Wi-Fi通讯模块的POCT台式或手持式设备已成为市场普遍接受的形式，而这样的发展会使得POCT测试生成连续和大量的数据流。如何让大数据变为智能化数据？也是摆在POCT生成制造厂商、医护检测人员和卫生健康政策研究者面前的现实问题。通过应用机器学习、深度学习技术，将已知数据与POCT设备进行关联，机器在学习阶段记忆足够样本量的阳性结果后可发展到智能的数据质量评估模式，对异常结果进行解释，评估在特定地区人群中采样后生成数据质量。这样的大数据的智能分析，在新冠疫情防控中有潜力成为公共卫生和流行病学监测的有力支持，如对确诊患者所在区域人群健康状态的监控，有利于医疗资源的智能分配。

结语

新冠疫情防控所催生的核酸检测需求极大地推动了POCT在此方面的技术研发和产品制造进展。随着应用前沿的POCT平台技术和检测技术，在保持快捷、简便、灵活、现场适用等优势的同时，POCT的核酸检测结果也有望媲美临床中心实验室的qRT-PCR检测。在针对目前存在的一些问题逐步做出解决，并向POCT检测结果的大数据、智能数据方向进一步发展，POCT将会成为临床检验领域重要的分支。-End-编辑

骆秉涵图片

freepik/unsplash

往期回顾

01

｜马学军

新型冠状病毒核酸检测的分子POCT检测技术应用与挑战

02

｜SARS-CoV-2的内耳感染

03

｜查出新冠核酸检测结果可疑，处理流程是什么？

04

｜新冠病毒：“清零还是共存”？

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